Nat. Comm. | 中山眼科中心刘奕志/胡友金团队开发新型单细胞测序方法，揭示视网膜发育过程中RNA异构体动态变化
单细胞RNA测序（scRNA-seq）可通过转录谱分析发育、再生、衰老、以及疾病发生过程中的细胞和分子机制。然而，目前大多数的定量方法局限在基因水平，无法区分具有不同结构和功能的转录异构体的差异表达。转录异构体间的结构差异的产生方式包括可变转录起始位点(TSS)，可变转录终止位点(TES)，以及可变剪切等。TSS和TES的差异可显著影响RNA的稳定性、定位以及翻译效率等，在视网膜发育过程中可影响视网膜干细胞的增殖、分化及细胞命运决定。
最近，中山大学中山眼科中心刘奕志/胡友金团队开发了一种低成本、高效的新型单细胞测序技术scRCAT-seq，并应用于分析人视网膜发育的细胞图谱，发现视网膜干细胞的分化及细胞命运决定过程中TSS和TES的变化规律。研究成果于2020年10月13日，在Nature Communications在线发表论文“Single-cell RNA cap and tail sequencing (scRCAT-seq) reveals subtype-specific isoforms differing in transcript demarcation”。
结合转录本首尾捕获和机器学习系统分析TSS和TES
以往研究表明，基因转录表达和转录异构体的选择在不同组织和细胞间均具有较强异质性，scRNA-seq技术已经广泛应用于分析不同单细胞间基因转录表达的差异。相比来说，用于分析不同单细胞之间转录异构体差异选择的方法还亟需开发。目前，大多数单细胞转录组方法基于RNA分子（5'或3'）的单端定量，因为仅提供一端的信息，而缺少另一端，所以不能分析完整的转录本；基于单细胞全长cDNA扩增的方法（例如Smart-seq2）可以检测全长cDNA，但其两端覆盖率较低，且不能准确地区分同一基因来源的不同转录本的TSS或者TES；基于三代测序技术的方法虽然能检测全长RNA异构体，但用于全基因组定量的成本太高，且准确性和重复性还有待提高。
在此研究中，scRCAT-seq通过对单细胞全长cDNA的5’及3’进行靶向捕获，基于常规的短读长测序平台进行测序（图1），结合随机森林（random forest, RF）等机器学习算法去除实验过程中由于RNA降解，internal priming，逆转录提前终止等不可避免因素所产生的假阳性TSS或TES，从而获得高准确性的TSS和TES（图2）。通过与已报道的测序方法进行比较，scRCAT-seq可显著提高所鉴定TSSs/TESs的准确性4-5倍。
scRCAT-seq的实验流程示意图
机器学习算法显著提高所鉴定TSSs/TESs的准确性
ScRCAT-seq具有低成本、高效率的特点
与已有的全长转录本测序方法Smart-seq2和ScISOr-seq相比，scRCAT-seq具有成本低，效率高等特点。以相同的成本，scRCAT-seq所能检测的转录本数量是ScISOr-seq的7倍（图3）。更进一步分析发现，scRCAT-seq能检测到大量ScISOr-seq所不能检测到的低表达的基因，显示了scRCAT-seq更高的检测效率。
scRCAT-seq具有高效率、低成本的特点
scRCAT-seq的可适性强
scRCAT-seq适用于分析不同物种来源、不同细胞类型和数量的样品。通过对小鼠卵细胞、背根神经节细胞、人胚胎干细胞、人视网膜色素上皮细胞、人视网膜前体细胞等，该研究发现scRCAT-seq在细胞分群，细胞类型特异的转录本鉴定等方面表现稳定。同时，在每种细胞类型中都能鉴定到上千种未标注的新的转录本，丰富了现有标注RNA转录本的数据库。scRCAT-seq可与单细胞三代测序技术，或者sanger测序技术结合，对全长转录本的结构，特别是内在外显子进行进一步鉴定，完善和挖掘新鉴定的转录本的转录剪切特征。
应用于分析人视网膜发育过程中转录组TSS和TES的动态变化
以人胚胎干细胞来源的视网膜类器官为研究对象，通过对10571个单细胞进行测序分析，该研究鉴定了不同细胞类型所表达的主要转录异构体，描绘了视网膜祖细胞（RPC）向光感受器前体细胞（PR precursors），进一步向视锥细胞（cone）分化的转录异构体的表达图谱，发现转录异构体变化最显著的时间点发生在RPC向光感受器前体细胞转变的节点。结合前期研究结果，作者发现CCND1异构体可能通过调节细胞周期，介导RPC向光感受器前体细胞的命运转换（图4），这与该团队前期研究发现的CCND1在视网膜神经发育过程中调节G1-S转换的重要的作用相一致。
人类视锥细胞发育过程中RNA异构体的动态变化
综上，scRCAT-seq是一种准确性高、成本低、效率高、可适性强的新的单细胞测序方法。scRCAT-seq可应用于发现特定细胞类型新基因及转录异构体，分析转录异构体的TSS及TES的动态变化，有望在单细胞基因组学领域（如人类细胞图谱计划中）得到广泛应用。
论文链接：
https://rdcu.be/b8rWZ